CN102604628B - 一种有机无机杂化磷光二氧化硅纳米粒子制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于发光纳米材料技术领域。具体涉及一类基于颜色可调铱配合物的有机/无机杂化二氧化硅纳米粒子的制备方法及其在生物成像领域中的应用。其中颜色可调铱配合物由环金属配体、金属中心和含氨基的邻菲咯啉衍生物配体组成。利用上述铱配合物中的氨基连接异氰酸丙基三乙氧基硅氧烷，再通过硅氧烷的水解将铱配合物连接到介孔二氧化硅纳米粒子上。本发明的磷光二氧化硅纳米粒子尺寸可控，粒径均匀，生物相容性好，表面也易于进一步功能化，在生物标记、检测和细胞靶向等领域有广阔的应用前景。

Description

一种有机无机杂化磷光二氧化硅纳米粒子制备及其应用

技术领域

本发明属于发光纳米材料技术领域。具体涉及一类基于颜色可调铱配合物的有机/无机杂化二氧化硅纳米粒子的制备及其在生物成像中的应用。

背景技术

生物医学成像可以在分子、细胞水平进行疾病的分析和诊断，减少对健康细胞核组织的影响。纳米探针一般使用生物相容性的粒子能够将细胞内环境与有毒的成像剂隔离，成像剂被包覆在基质中可以防止成像剂受到来自细胞内环境的任何可能的干扰，纳米级的尺寸能够降低细胞的物理干扰，并且小尺寸能够提供快速的响应时间，不同的成像剂可以同时包覆于相同的粒子中，使的利用比度法进行测量成为可能。所以利用生物相容性的纳米粒子运载合适的成像剂用于细胞成像，同时连接上靶向配体赋予其癌细胞靶向的功能具有重大的意义。

在现有的纳米生物成像技术中，荧光染料因其简便与通用性而得到广泛应用。相比有机荧光，具有d⁶、d⁸和d¹⁰电子结构的磷光重金属配合物具有优异的光物理性质，如大的斯托克斯位移可以很容易区分激发和发射峰，能使用可见光进行激发，长的发射寿命有利于使用时间分辨技术有效地与背景荧光信号区分开以提高检测的信噪比和灵敏度等。

然而，大多数的金属配合物磷光成像剂由于疏水性和毒性很难进入细胞，实现成像功能。因此，有必要选择合适的纳米载体，运载金属配合物磷光成像剂，普遍性的实现金属配合物的生物成像功能。介孔纳米二氧化硅以其规则的介孔结构、尺寸可调、容易功能化、显著的生物相容性，以及光学上的透明性越来越多的受到人们的关注，成为一种有效的纳米载体。将金属配合物磷光成像剂通过介孔纳米二氧化硅的运载，有效的弥补了金属配合物磷光成像剂的不足，并将其独特的光学性质用在在细胞和生物体的成像中，因此有机/无机杂化磷光二氧化硅纳米粒子的研究具有深远的科学意义和应用价值。

鉴于此，本发明将具有颜色可调性能的磷光重金属铱配合物与二氧化硅纳米粒子杂化，从而制备出低毒、发光颜色可调的、形貌规则、大小可控的磷光二氧化硅纳米粒子，并探索其在生物成像上的应用，从而为其未来的应用提供必要的理论数据。

发明内容

技术问题：本发明的目的在于提供一类基于颜色可调铱配合物的有机/无机杂化介孔二氧化硅纳米粒子，给出它们的制备方法，并提出这类配合物在细胞标记、成像中的应用。利用扫描电子显微镜和透射电子显微镜观测纳米粒子的形貌，热重分析测试杂化粒子中有机分子含量，紫外-可见吸收光谱、荧光发射光谱检测杂化纳米粒子的光物理性质。

技术方案：本发明是一种有机无机杂化磷光二氧化硅纳米粒子，有机磷光染料通过有机硅氧烷的共价连接分布在介孔二氧化硅纳米粒子的介孔结构中与粒子表面上，形成的有机无机杂化磷光二氧化硅纳米粒子孔径在2-5nm，粒径在50-200nm，为一种有机磷光染料包覆介孔二氧化硅内外表面的有机无机杂化结构。

该方法包括：1)颜色可调磷光前躯体的制备；2)颜色可调磷光前驱体和纳米二氧化硅粒子的杂化，具体如下：

1)颜色可调磷光前驱体的制备：

其中

为具有以下结构的杂环化合物：

具体是将C^N配体与IrCl₃·3H₂O在3∶1，v/v的2-乙氧基乙醇和水的混和溶剂中回流反应，反应完全后得到的二氯桥中间体与邻菲咯啉衍生物在2∶1v/v的二氯甲烷与甲醇的混合溶剂中回流，然后加入六氟磷酸钾室温搅拌，旋出溶剂，将得的固体用柱层析方法分离，即得到上述颜色可调铱配合物；

2)颜色可调磷光前驱体和纳米二氧化硅粒子的杂化：

通过硅氧烷连接有机磷光染料和介孔二氧化硅纳米粒子，即将铱配合物与异氰酸丙基三乙氧基硅氧烷在四氢呋喃中80-100℃反应24-72小时，将得到的铱配合物硅烷与介孔二氧化硅纳米粒子在四氢呋喃中混合，室温搅拌10-24小时，用乙醇反复离心洗去未连接上的铱配合物硅烷和异氰酸丙基三乙氧基硅烷，即得到颜色可调介孔纳米二氧化硅粒子。

连接有机磷光染料与介孔二氧化硅纳米粒子的硅氧烷是异氰酸丙基三乙氧基硅氧烷。

该有机无机杂化磷光二氧化硅纳米粒子的应用于生物成像中。

有益效果：通过核磁共振(NMR)、色质联机(GCMS)、基质辅助激光解析时间飞行质谱(MALDI-TOF-MS)等表征铱配合物材料及中间体的结构，利用扫描电子显微镜和透射电子显微镜观测纳米粒子的形貌，热重分析测试杂化粒子中有机分子含量，利用紫外吸收光谱、荧光发射光谱检测纳米粒子的光物理性质。

本发明由C^N配体的共轭程度调节配合物的发光颜色，通过介孔纳米二氧化硅粒子的运载，实现铱配合物的水溶性，从而实现在细胞成像中的应用。

附图说明

图1、本发明中磷光二氧化硅纳米粒子的结构图。

图2a为颜色可调配合物，图2b为颜色可调纳米二氧化硅粒子。

图3a为颜色可调配合物，图3b为颜色可调纳米二氧化硅粒子。

图4a为扫描电镜照片，图4b为透射电镜照片。

图5、本发明中合成的颜色可调二氧化硅纳米粒子的细胞毒性测试图。

具体实施方式

本发明提出可用于细胞成像的颜色可调铱配合物有机/无机杂化二氧化硅纳米粒子。其中：

a.本发明提出的颜色可调磷光铱配合物合成路线如下：

具体是将

(C^N配体)与IrCl₃·3H₂O在2-乙氧基乙醇和水的混和溶剂(3∶1，v/v)中回流反应18-24小时，得到的二氯桥中间体与邻菲咯啉衍生物在二氯甲烷与甲醇的混合溶剂(2∶1，v/v)中回流3-6小时，然后加入六氟磷酸钾室温搅拌1-3小时后，旋出溶剂，将得的固体用柱层析方法分离，即得到上述颜色可调铱配合物。

b.本发明提出的二氧化硅纳米粒子制备方法如下：

具体是将十六烷基溴化铵溶解在氢氧化钠的稀溶液中，60-90℃加热搅拌至溶液澄清，加入正硅酸乙酯，在相同温度下加热搅拌2-3小时。将得到的混合溶液进行抽滤，并用纯水冲洗，将得到的沉淀加到浓盐酸和乙醇的混合溶液中，50-80℃加热搅拌10-24小时，将得到的混合溶液进行抽滤并反复洗涤，即得到介孔二氧化硅纳米粒子。

c.本发明提出的可用于生物成像的颜色可调铱配合物杂化二氧化硅纳米粒子制备路线如下：

具体是将覆盖可见光范围的颜色可调铱配合物与异氰酸丙基三乙氧基硅烷在四氢呋喃中80-100℃反应24-72小时，将得到的铱配合物硅烷与二氧化硅纳米粒子在四氢呋喃中混合，室温搅拌10-24小时，用乙醇反复离心洗去未连接上的铱配合物硅烷和异氰酸丙基三乙氧基硅烷，即得到上述可用于生物成像的颜色可调介孔纳米二氧化硅粒子。

为了更好地理解本发明专利的内容，下面通过具体的实例来进一步说明本发明的技术方案。具体包括合成、性质测定，细胞成像实验。但这些实施例并不限制本发明。

实施例1：颜色可调铱配合物的制备：

a)5-硝基-1，10-邻菲咯啉的制备

在圆底烧瓶中加入5g 1，10-邻菲咯啉水合物，加入30ml浓硫酸溶解，然后逐滴加入15ml发烟硝酸，加热溶液使其温度保持在160-170℃，反应回流2小时。反应完毕，使其冷却至室温，之后将溶液倾倒入冰水中。加入浓度为10％的氢氧化钠溶液把pH调为3。析出的黄色沉淀为产物，抽滤，用清水洗并在真空中干燥。得5g(88％)淡黄色固体。GC-MS(EI-m/z)：测试值：225，理论值：225.2。

b)5-氨基-1，10-邻菲咯啉(apt)的制备

将1.0g 5-硝基-1，10-邻菲咯啉溶解在30ml无水乙醇中，加入0.2g 5％Pd/C催化剂，在氮气保护下加热到70℃，然后逐滴加入10ml无水乙醇与10ml水合肼混合液，回流反应5h。反应完成后，让其冷却至室温，过滤掉Pd/C催化剂，用乙醇洗涤数次。将滤液蒸去大部分乙醇，冷却，析出黄色固体，抽滤，干燥，得黄色固体(0.67g，76％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)9.21(d，1H)，8.95(d，1H)，8.28(d，1H)，7.99(d，1H)，7.66(dd，1H)，7.52(dd，1H)，6.9(s，1H)，4.3(s，2H)。

c)配合物1([Ir(dfppy)₂apt]⁺PF₆ ^-)的制备

1 Ir(dfppy)₂apt]⁺PF₆ ^-

称取2-(2′，4′-二氟苯基)吡啶3.3mmol，IrCl₃·3H₂O1.4mmol于反应瓶中，加入2-乙氧基乙醇和水的混合物(3∶1，v/v)，100-120℃氮气氛围搅拌，反应24小时左右。将反应体系冷却至室温，然后将沉淀过滤，并用水、乙醇反复冲洗，得到固体产物为铱二氯桥化合物。

称取铱二氯桥化合物0.15mmol和5-氨基-1，10-邻菲咯啉(apt)0.375mmol加入到反应瓶中，再加入15ml CH₂Cl₂和甲醇的混合溶剂(2∶1，v/v)，磁搅拌下回流。3-5小时后，降至室温，加入5倍当量的六氟磷酸钾(KPF₆)，继续搅拌约1小时后，减压旋蒸除去溶剂，将所得固体混合物再溶于约10ml的CH₂Cl₂中，将不溶物过滤除去，滤液减压旋蒸除去溶剂后所得固体用柱层析(二氯甲烷/丙酮)分离得到纯品。产率67％。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ＝6.98(s，4H)，7.05-7.12(m，3H)，7.48-7.51(t，1H)，7.70-7.73(m，1H)，7.79(d，1H)，7.93-7.99(m，4H)，8.21(d，1H)，8.26(d，2H)，8.42(d，1H)；MS(Maldi-tof)[m/z]：测试值：768.435(M-PF₆)，理论值：767.775(M-PF₆)。

d)配合物2([Ir(ppy)₂apt]⁺PF₆ ^-)的制备方法与配合物1相同。

2 [Ir(ppy)₂apt]⁺PF₆ ^-

产率71％。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ＝6.91-6.94(m，4H)，6.97-7.05(m，4H)，7.09(s，1H)，7.42-7.45(t，2H)，7,68-7.73(m，2H)，7.84-7.88(t，2H)，7.90-7.93(t，2H)，8.12(d，1H)，8.22(d，2H)，8.37(d，1H)，8.39(d，1H)；MS(Maldi-tof)[m/z]：测试值：696.516(M-PF₆)，理论值：695.813(M-PF₆)。

e)配合物3([Ir(thq)₂apt]⁺PF₆ ^-)的制备方法与配合物1相同。

3 [Ir(thq)₂apt]⁺PF₆ ^-

产率63％。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ＝6.35(s，2H)，6.85(s，1H)，6.92(d，2H)，7.17-7.21(m，4H)，7.37-7.41(t，2H)，7.54-7.59(m，4H)，7.77-7.87(m，4H)，7.98-8.07(m，4H)，8.31(d，1H)，8.71(d，1H)；MS(Maldi-tof)[m/z]：808.375(M-PF₆)，理论值：807.986(M-PF₆)。

实施例2：具有生物成像功能的发光颜色可调磷光介孔二氧化硅纳米粒子的制备

具体是将十六烷基溴化铵溶解在氢氧化钠的稀溶液中，80℃加热搅拌至溶液澄清，加入正硅酸乙酯，在相同温度下加热搅拌2-3小时。将得到的混合溶液进行抽滤，并用纯水冲洗，将得到的沉淀加到浓盐酸和乙醇(1∶12，v/v)的混合溶液中，60℃加热搅拌过夜，将得到的混合溶液进行抽滤并反复洗涤，得到的白色粉末即为介孔二氧化硅纳米粒子，呈规则球形，粒径在70-100nm，孔径约为3nm左右。

将铱配合物与异氰酸丙基三乙氧基硅烷在四氢呋喃中80℃反应3天，将得到的铱配合物硅烷与上述二氧化硅纳米粒子在四氢呋喃中混合，室温搅拌24小时，用乙醇反复离心洗去未连接上的铱配合物硅烷和异氰酸丙基三乙氧基硅烷，即得到上述颜色可调介孔纳米二氧化硅粒子，粒径在70-100nm，孔径约为2-3nm左右。

实施例3：铱配合物的紫外-可见光谱测试：配置20μM的配合物的二氯甲烷溶液，移取2ml配合物溶液于荧光比色皿中，分别测得配合物的紫外-可见发光谱图，如图1a。

实施例4：铱配合物的荧光发射光谱测试：配置20μM的配合物的二氯甲烷溶液，移取2ml配合物溶液于荧光比色皿中，分别测得荧光发射光谱图，如图2a。

实施例5：配合物杂化二氧化硅纳米粒子的紫外-可见光光谱测试：配置0.5mg/ml的配合物杂化二氧化硅纳米粒子水溶液，移取2ml配合物溶液于荧光比色皿中，分别测得配合物的紫外-可见发光谱图，如图1b。

实施例6：配合物杂化二氧化硅纳米粒子的荧光发射光谱测试：配置0.5mg/ml的配合物杂化二氧化硅纳米粒子水溶液，移取2ml配合物溶液于荧光比色皿中，分别测得配合物的荧光发射光谱图，如图2b。

实施例7：配合物杂化二氧化硅纳米粒子的活细胞成像实验：

采用1ml的细胞培养液配制2mg的配合物杂化二氧化硅纳米粒子，浓度为2mg/ml。取100μL稀释至成像所需浓度：100μg/ml。分别取2ml溶液孵育细胞8小时后用PBS缓冲液清洗细胞3-5次，用405nm波长激发细胞共聚焦成像，Z扫描。测试数据表明：配合物杂化二氧化硅纳米粒子具有良好的细胞穿透性，分布在细胞质区域。

实施例8：配合物杂化二氧化硅纳米粒子的毒性实验：

取对数期的人胶质瘤细胞U87MG接种在96孔细胞培养板上(1×10⁴个细胞/孔)，在5％CO₂，37℃下孵育24小时。配合物杂化二氧化硅纳米粒子(100μl/孔，含1％HEPES)分别以50，100，150，200μg/ml的浓度加入到实验组的细胞中。将含1％HEPES的MEM培养基(100μl/孔)加入到对照组的细胞中。细胞在5％CO₂37℃下继续孵育24小时后，每孔加入10μl MTT(5mg/ml)，在5％CO₂37℃下再孵育4小时。然后每孔加入10％SDS(100μl/孔)，在室温静置12小时。用多功能酶标仪TecanInfinite M200测定690nm波长下扣除背景后的每孔的OD570(吸光度)。

按以下公式计算细胞生长存活率：

细胞存活率(％)＝(实验组的吸光度平均值/对照组的吸光度平均值)×100。

Claims (2)

1.一种有机无机杂化磷光二氧化硅纳米粒子的制备方法，其特征在于有机磷光染料通过有机硅氧烷的共价连接分布在介孔二氧化硅纳米粒子的介孔结构中与粒子表面上，形成的有机无机杂化磷光二氧化硅纳米粒子孔径在2-5nm，粒径在50-200nm，为一种有机磷光染料包覆介孔二氧化硅内外表面的有机无机杂化结构；

该方法包括：1）颜色可调磷光前躯体的制备；2）颜色可调磷光前驱体和纳米二氧化硅粒子的杂化，具体如下：

1）颜色可调磷光前驱体的制备：

其中

为具有以下结构的杂环化合物：

具体是将C^N配体与IrCl₃·3H₂O在3:1,v/v的2-乙氧基乙醇和水的混和溶剂中回流反应，反应完全后得到的二氯桥中间体与邻菲咯啉衍生物在2:1v/v的二氯甲烷与甲醇的混合溶剂中回流，然后加入六氟磷酸钾室温搅拌，旋出溶剂，将得的固体用柱层析方法分离，即得到上述颜色可调铱配合物；

2）颜色可调磷光前驱体和纳米二氧化硅粒子的杂化：

通过硅氧烷连接有机磷光染料和介孔二氧化硅纳米粒子，即将铱配合物与异氰酸丙基三乙氧基硅氧烷在四氢呋喃中80-100℃反应24-72小时，将得到的铱配合物硅烷与介孔二氧化硅纳米粒子在四氢呋喃中混合，室温搅拌10-24小时，用乙醇反复离心洗去未连接上的铱配合物硅烷和异氰酸丙基三乙氧基硅烷，即得到颜色可调介孔纳米二氧化硅粒子。

2.按照权利要求1所述的有机无机杂化磷光二氧化硅纳米粒子的制备方法，其特征在于，连接有机磷光染料与介孔二氧化硅纳米粒子的硅氧烷是异氰酸丙基三乙氧基硅氧烷。

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